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本产品是一种高效高产的膜蛋白提取试剂盒，可以从各种植物中提取总膜蛋白，可用于纯化蛋白的粗品制备及膜蛋白制备。提取过程简单方便。该试剂盒含有蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高质量的蛋白提供了保证。

本试剂盒提取的蛋白可用于WB、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用其他货号试剂盒(HR0177)。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理（货号HR0389）。

• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
  
• 离心机转速有相对离心力（RCF，×g）和每分钟转速（RPM）两种表示方式，有些离心机设置有RPM和×g显示切换，但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算：
  g=r×1.118×10^-5×rpm²（r为有效离心半径，即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度，单位为厘米）
  例如：转速为3000rpm，有效离心半径为10cm，则相对离心力（RCF，×g）为=10×1.118×10^-5×3000²=1006.2（×g）。

• 提取液制备：
  每500μL冷提取液A中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，充分混匀后置冰上备用。
  注：
  ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
  ● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
  
• 取洗净擦干后并去除叶梗和粗脉的100～200mg植物组织样本用手术剪刀尽可能剪碎。
  
• 加入500μL提取液A，用匀浆机充分匀浆。
  注：
  ● 也可液氮研磨处理后加入提取液A。
  ● 没有液氮研磨条件也可以直接加入冷的提取液A在冰上研磨处理。
  ● 如果组织样本很小，可剪碎后直接加入提取液2～8℃振荡，可以不用匀浆器。
  
• 将匀浆移入另一个预冷的干净离心管中2～8℃条件下振荡1～2小时。
  注：
  ● 此步骤必须在2～8条件下进行。
  ● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
  ● 如果没有2～8℃持续振荡条件，也可直接置2～8℃冰箱静置1～2小时，中间每隔10分钟涡旋振荡混匀。
  
• 将提取液在2～8℃低温条件下12000×g离心5分钟，取上清。
  
• 在上清中加入5μL提取液B，充分混匀。
  
• 在37℃水浴10分钟。
  
• 在37℃温度下，1000×g离心3分钟。
  注：
  ● 此步骤必须37℃条件下离心。
  ● 如果离心机不可控温，可以不离心，延长上一步骤水浴时间，至溶液分层清晰即可。或者在室温条件下离心，缩短离心时间至1分钟。
  
• 此时溶液分为两层，小心移除上层，留下管底部下层大约30～50μL液体。
  注：
  ● 下层为粘稠状液体。
  ● 含叶绿体的植物样本下层膜蛋白为黄绿色。通常不影响下游应用。
  
• 用50～150μL冷的膜蛋白溶解液C溶解下层溶液，即得膜蛋白样品。
  注：
  ● 膜蛋白如果不能很快溶解混匀，可以在加入溶解液后稍微吹打混匀，然后置于4℃冰箱静置10分钟。静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。
  ● 如果4℃静置10分钟后仍未有效混匀，可以稍微延长静置时间。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  注：
  ● 建议用BCA方法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。
  ● 蛋白样品-80℃存放一年没问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 蛋白浓度低？
  膜蛋白丰度比较低，需要尽可能加大细胞上样量。处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。